CRISPR-Cas9是近年来兴起的基因组编辑工具，已被应用在水稻、玉米和拟南芥等二倍体植物中构建靶向敲除突变体库，但应用到四倍体作物中还鲜有报道。异源四倍体甘蓝型油菜（Brassica napus, AACC, 2n=38）是我国第一大油料作物，利用CRISPR-Cas9对其复杂基因组进行高通量靶向突变，将为具优异性状的新种质的高通量创建、重要新基因的批量挖掘、乃至油菜分子设计育种奠定坚实基础。

2023年6月8日，华中科技大学栗茂腾教授团队联合华中农业大学张椿雨教授团队在生物学国际权威期刊Genome Research上发表了题为Genome-scale targeted mutagenesis in Brassica napus using a pooled CRISPR library的研究论文。该研究通过混合的CRISPR文库在甘蓝型油菜中构建了高通量的靶向敲除突变体库并评估了靶点的编辑效率。本突变体库是利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在甘蓝型油菜中构建的第一个高通量靶向敲除突变体库，并通过正、反向遗传学筛选，获得了系列影响含油量等重要农艺性状的新基因。

在本文中，作者首先设计了18414个sgRNA以用于靶向10480个与油菜生殖器官发育和种子形成等相关基因。将该混合的CRISPR-Cas9表达文库遗传转化甘蓝型油菜获得1104个转基因再生株系。测序分析结果表明，所检测的178个靶基因里有93个发生了靶点编辑，即评估的靶点编辑效率为52.2%。研究发现，当sgRNA同时靶向多个油菜基因同源拷贝时，Cas9蛋白倾向于切割所有的拷贝从而实现靶位点的编辑。同时，作者利用已检测过靶点编辑情况的转基因株系对多种重要表型进行了反向遗传学筛选，验证了该突变体库高通量筛选特征及部分基因的功能；并进一步通过正向遗传学筛选挖掘到系列控制种子含油量或脂肪酸组分等重要农艺性状的新基因，这些基因的编辑可明显改变种子的含油量或脂肪酸组分。

该工作为甘蓝型油菜基因功能的高通量研究提供了宝贵种质资源，所发掘的系列调控含油量等重要农艺性状的新基因，为油菜重要农艺性状的分子改良提供了有价值的基因资源。同时，该研究也为其它多倍体植物开展高通量的靶向突变提供了一个有益的借鉴。

华中科技大学栗茂腾教授和华中农业大学张椿雨教授为论文共同通讯作者，博士生何坚杰及张凯博士为共同第一作者，博士生闫书祥、硕士生唐蜜和周惟贤、尹永泰博士和陈康博士也参与了此项研究。本研究得到国家重点研发计划“油菜和花生重要基因资源挖掘与利用”（2022YFD1200402）和国家自然科学基金面上项目 (32272067和32072098) 的资助。

论文链接：https://genome.cshlp.org/content/early/2023/05/30/gr.277650.123.full.pdf+html